Міжрегіональне співробітництво України з Чеською Республікою  здійснюється у рамках двосторонніх угод між регіонами України та Чехії.

Між двома країнами на міжрегіональному рівні укладено 30 угод про співпрацю, партнерськими відносинами пов’язані 20 міст і містечок обох країн. Встановлено контакти між 6 областями України та 10 краями Чеської Республіки.

Найактивнішою є співпраця з чеськими краями Закарпатської області, яка відбувається в рамках Угод про торговельно-економічне, науково-технічне та культурне співробітництво з Пардубіцьким, Устецьким, Кралово-Градецьким, Мораво-Сілезьким краями та краєм Височина.

Активно розвивається також співпраця між Вінницькою областю і Ліберецьким краєм, Київською областю і Центральночеським краєм, Львівською областю і Південно-Моравським краєм та Черкаською областю і Злінським краєм.

У 2021 році відбулося декілька офіційних візитів делегацій чеських країв до своїх партнерських регіонів в Україні.

У серпні 2021 року делегація Ліберецького краю Чеської Республіки на чолі з гетьманом Мартіном Путою взяла участь в урочистих заходах з нагоди відзначення 30-ї річниці незалежності України у Вінницькій області.

14-16 вересня 2021 року делегація Центральночеського краю на чолі гейтманкою Петрою Пецковою відвідала Київ та Київську область на запрошення голови Київської ОДА Василя Володіна. Чеська делегація обговорила з представниками Київської області можливості співпраці в економічній, культурній, туристичній та гуманітарній сферах. Делегації було також представлено потенціал розвитку Чорнобильської зони відчуження. Керівництво Центральночеського краю та Київської області домовилося про активізацію відносин у наступні роки, включно із візитом делегації Київської області до Праги у 2022 році.

У жовтні 2021 року делегація краю Височина на чолі з гетьманом Вітєзславом Шреком відвідала з робочим візитом Закарпатську область. Переговори з керівництвом Закарпатської області були зосереджені переважно на оцінці поточної співпраці у 2021 році та обговоренні її подальшого продовження у 2022 році, коли Височина та Закарпаття відзначатимуть 15-ту річницю встановлення партнерських відносин.